Pengertian dan Prinsip Kerja Real Time PCR

Real Time PCR adalah teknik yang digunakan untuk memonitor progress reaksi PCR pada waktu yang sama (Biosoft, 2007). RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat dihitung secara kuantitatif. 

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green atau EvaGreen®Reagents ) atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes). 

Analisis menggunakan Real time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR tertentu. Real time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung pada waktu yang bersamaan. Real Time-RT PCR memiliki tambahan siklus Reverse Transcription yang memacu perubahan molekul DNA dari molekul RNA. Real Time-RT PCR diperlukan karena RNA kurang stabil dibandingkan dengan DNA.

Gambar 2. Proses Real Time PCR pada deteksi target non-spesifik (Fraga et al., 2008).

Pada prosedur Real Time PCR, molekul reporter dengan fluoresensi (pada Gambar 2 ditunjukkan dengan bagian berwarna hijau) digunakan untuk memonitor proses PCR. Fluoresensi akan dipendarkan oleh molekul sebagaimana terakumulasinya produk PCR pada tiap siklus proses amplifikasi. Berdasar pada molekul yang digunakan untuk deteksi, teknik Real Time PCR dapat dibedakan sebagai berikut: 

Pada Real Time PCR, pewarna DNA digunakan sebagai reporter fluoresensi untuk memonitor reaksi Real Time PCR. Fluoresensi pada reporter akan terakumulasi seiring dengan proses amplifikasi yang berlangsung. Pencatatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung pancaran fluresensi tiap siklus PCR. Hal tersebut mungkin untuk dilakukan guna memonitor reaksi PCR selama fase eksponensial.  Jika grafik digambarkan antara log jumlah awal template dan hubungan peningkatan fluoresensi reporter selama proses Real Time PCR, maka akan didapatkan suatu garis hubungan yang menunjukkan kuantitas gen yang diekspresikan.

Deteksi target spesifik Real Time PCR dilakukan menggunakan beberapa probe oligonucleotide yang dilabeli pada dua bagian reporter dengan label (pewarna) fluoresensi/fluorescent dye dan pewarna quencher/ quencher dye. 

Kuantitas mRNA dalam sel merupakan parameter jumlah gen yang terekspresi. Untuk menganalisa tingkat ekspresi gen, cDNA yang telah disintesis dari mRNA diuji secara kuantitatif menggunakan real time PCR. Analisis hasil real time PCR dapat dilakukan secara absolute quantification dan relative quantitation. Metode relative quantitation atau yang dikenal juga dengan comparative threshold method menghilangkan kebutuhan akan kurva standar yang digunakan dalam perhitungan absolute quantification dan menggunakan perhitungan secara matematika untuk mengukur tingkat kuantitatif relatif ekspresi dari gen target dengan menggunakan gen referensi dan kalibrator dari jaringan (Arya et al., 2005).  

Untuk mengetahui ekspresi suatu gen maka dibutuhkan gen referensi sebagai pembanding internal (endogenous control) jumlah DNA agar tidak terjadi kesalahan interpretasi akibat jumlah DNA yang berbeda. Gen referensi yang digunakan adalah gen yang tidak terpengaruhi oleh lingkungan. Gen yang paling banyak digunakan adalah housekeeping gene seperti actin dan gliseraldehida-3-fosfat-dehidrogenase (GAPDH) (Bustin, 2000).

Hasil real time PCR dengan metode comparative threshold meliputi nilai Cq dan relative quantitation. Cq merupakan hasil fraksi jumlah siklus PCR dimana nilai reporter fluoresensi lebih besar dari tingkat deteksi minimal mesin real time PCR sehingga amplicon meningkat secara signifikan. Nilai Cq didapat dari jumlah siklus pada proses PCR yang berpotongan dengan garis threshold. Threshold adalah garis yang menandai peningkatan sinyal fluoresensi secara signifikan berdasarkan variabilitas baseline, namum posisi threshold dapat diatur bebas pada setiap titik di fase eksponensial (Life TechnologiesTM, 2012). 

Nilai relative quantitation dihitung berdasarkan satuan massa dengan rasio nilai Cq kalibrator dengan Cq sampel dengan bentuk rumus:

E adalah nilai efisiensi amplifikasi yang menjelaskan berapa banyaknya target yang diproduksi dalam setiap siklus PCR. Jika proses PCR efisien 100%, maka setiap siklus akan memproduksi dua kali lipat hasil dari template semula. E bernilai 2 jika amplifikasi PCR 100% efisien (Bio-Rad, 2006). Jika E bernilai 2, maka perhitungannya menjadi sebagai berikut:

Rasio(sampel/kalibrator) = 2^{Cq (kalibrator)-Cq (sampel)} ;atau

Rasio(sampel/kalibrator) = 2^DCq ; dimana DCq = Cq(kalibrator) – Cq(sampel)

Analisis relative quantitation menggunakan gen referensi yang umum digunakan adalah Livak Method atau yang dikenal juga dengan metode  2^–DDCq dan metode Pfaffl. Pada metode ini diperlukan formula rumus alternatif untuk menentukan ekspresi relatif gen target pada sampel yang berbeda-beda (Pfaffl, 2001). 

Untuk menentukan rasio antara sampel dan kalibrator, digunakan rumus berikut ini:

Aplikasi dari Real Time PCR (Biosoft, 2007) antara lain digunakan sebagai studi expresi gen secara kuantitatif, penghitungan jumlah copy DNA (cDNA) pada genom atau DNAs virus,  analisis pembedaan alel atau genotiping Single Nucleotide Polymorphism SNP, untuk verifikasi hasil microarray, keefektifan obat terapi, penghitungan kerusakan DNA.

Perbedaan Real Time PCR dan PCR biasa yaitu, dengan Real Time PCR deteksi produk PCR dapat dihasilkan pada fase awal reaksi. PCR biasa hanya menggunakan Electrophoresis gel untuk deteksi produk amplifikasi PCR pada fase akhir, tanpa mengetahui jumlah produk PCR yang diekspresikan atau dihasilkan.