“Gold Standard” Identifikasi Bakteri berdasarkan Gen 16S rRNA

Pendekatan kredibel pertama klasifikasi bakteri dimulai pada akhir abad ke-19. Studi awal membedakan kelompok bakteri berdasarkan morfologi, ukuran, dan motilitas. Beberapa penelitian menyimpulkan bahwa filogenetik menggunakan wilayah genom yang dilestarikan lebih stabil untuk mengidentifikasi. Oleh karena itu, penggunaan rRNA hadir untuk menghubungkan perbandingan filogenetik. Tiga molekul rRNA, yaitu gen 5S, 16S, dan 23S. Ternyata gen 16S rRNA merupakan penanda filogenetik yang paling umum digunakan dalam bidang taksonomi mikroba.

Apa itu 16S rRNA?

Gen 16S rRNA mengkode molekul RNA ribosom subunit kecil dari ribosom, bertanggung jawab untuk mengubah pesan genetik menjadi komponen sel fungsional melalui terjemahan mRNA menjadi protein. Huruf “S” pada 16S adalah koefisien sedimentasi, indeks yang menunjukkan penurunan kecepatan makromolekul dalam medan sentrifugal. Tahun 1970an diperkenalkan 16S-rRNA untuk identifikasi bakteri. RNA ribosom 16S  digunakan secara luas dalam klasifikasi dan identifikasi Bakteri dan Archaea. Namun, tidak berlaku untuk beberapa genera dan hanya memberikan informasi hingga tingkat genus.

Jumlah salinan

Bakteri terdiri dari sekitar 5 hingga 10 salinan 16S rRNA, sehingga pendeteksiannya sangat sensitif.

Ukuran

Gen pengkode 16S rRNA sekitar 1500 bp yang mengandung 50 domain fungsional.

Manfaat menggunakan RNA ribosom dalam teknik molekuler

1. RNA ribosom dan ribosom terlihat di semua sel
2. Gen RNA dilestarikan
3. Kultur sel mikroba tidak terlihat pada teknik sekuensing

Aplikasi 16S rRNA

Peneliti dapat menggunakan 16S rRNA untuk studi lingkungan dan klinis. Misalnya, mikrobioma bumi, keanekaragaman bakteri di tanah, pasir pantai, dan lingkungan laut. Bidang Klinis, 16S rRNA digunakan untuk iagnostik mengidentifikasi spesies bakteri menular karakterisasi peran keanekaragaman bakteri dalam penyakit seperti diabetes, Alzheimer, kanker, dan autisme. Selain itu diterapkan pada mikrobioma manusia untuk karakterisasi komunitas bakteri yang ada di usus manusia, kotoran, kulit, dan area tubuh lainnya.

Gen 16S rRNA sebagai “Gold Standard” identifikasi bakteri

Hal ini karena Gen 16S rRNA memiliki beberapa keunggulan, diantaranya.

1. Bersifat universal, gen RNA ribosom 16S mengkode komponen RNA subunit 30S ribosom bakteri. Ini banyak terdapat di hampir semua spesies bakteri. Sehingga hubungan filogeni dapat diukur dan diketahui antar semua spesies bakteri.
2. Gen 16S rRNA diperkirakan hanya sedikit terpengaruh oleh transfer gen horizontal, mendukung untuk studi filogenetik. 
3. Gen 16S rRNA memiliki panjang sekitar 1.550 bp cukup besar untuk keperluan informatika, polimorfisme interspesifik untuk memperlihatkan perbedaan dan pengukuran yang valid secara statistik.
4. Memiliki daerah yang dilestarikan (conserved regions) sekitar 540 bp. Daerah lestari ini berguna untuk merancang primer universal yang memungkinkan amplifikasi berbagai wilayah hipervariabel dari gen 16S rRNA mikroorganisme yang ditemukan dalam suatu komunitas.
5. Memiliki daerah variabel (V1-V9) memungkinkan untuk membedakan organisme dalam genus, bahkan spesies namun tidak antar strain dalam spesies yang sama. Daerah variabel gen 16S rRNA berperan untuk studi filogenetik dan taksonomi.

Prosedur Identifikasi Bakteri Secara Molekuler

1. Ekstraksi DNA Bakteri

Isolasi DNA, langkah awal lisis sel, Lisis sel biasanya dilakukan dengan metode kimia seperti deterjen atau enzim. Secara umum, bakteri gram positif lebih sulit untuk dilisis dibandingkan bakteri gram negatif, dan lisis yang tidak sempurna memungkinkan kesalahan dalam menggambarkan profil taksonomi. Tahap selanjutnya pengendapan, DNA perlu dipisahkan dari semua isi sel lainnya. Hal ini dilakukan dengan menambahkan larutan garam dan alkohol. Kemudian pemurnian, DNA isolasi kemudian dicuci untuk menghilangkan pengotor lainnya dan kemudian disuspensikan kembali dalam larutan air.

2. Amplifikasi gen 16S rRNA

DNA yang telah diekstraksi digunakan sebagai cetakan untuk mengamplifikasi segmen sekitar 500 atau 1.500 bp dari urutan gen 16S rRNA menggunakan Polymerase chain reaction (PCR). Pada prinsipnya, primer harus sesuai dengan wilayah yang dilestarikan untuk memperkuat semua gen 16S rRNA, dan amplikon harus mencakup wilayah variabel untuk klasifikasi taksonomi bakteri. Untuk itu, perlu digunakan primer spesifik menargetkan salah satu daerah hipervariabel (V1-V9) pada gen 16S rRNA, yang sesuai dengan jenis sampel. Misalnya set primer yang sering digunakan adalah F27-R534, F9-R534 (mencakup V1–V3), F357-R926 (V3–V5), dan F515-R926 (V4–V5). Karena wilayah V1–V3 telah diidentifikasi sebagai wilayah yang paling berguna untuk membedakan spesies genus bakteri kulit Staphylococcus.

3. Elektroforesis

Visualisasi gen 16S rRNA. Gen yang telah diamplifikasi, diseparasi dengan menggunakan elektroforesis gel. Visualisasi dilakukan menggunakan pewarna tertentu dan dideteksi dengan sinar UV pada UV-transiluminator. Hasil deteksi didokumentasikan menggunakan gel documentation system (gel-doc).

4. Sekuensing DNA

DNA Sekuensing dapat dilakukan baik dengan Metode Sanger atau dengan menggunakan Sequencers DNA modern. Saat ini, ketersediaan alat di Indonesia masih sangat terbatas, sehingga biasanya untuk melakukan proses sekuensing, mengirimkan sampel yang terdapat di luar negeri.

5. Membandingkan Hasil Sekuensing dengan Bank Data

Hal ini digunakan untuk pencarian kemiripan sekuen dengan database yang tersedia. Teknik umum yang digunakan adalah Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) di NCBI. Sumber data lain yang bisa digunakan diantaranya adalah Ribosomal Data-base Project (RDP-II), Ribosomal Database Project European Molecular Biology Laboratory, Smart Gene IDNS, dan Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms (RIDOM).

Referensi:

1. Athanasopoulou, K., Adamopoulos, P.G., Scorilas, A. Unveiling the Human Gastrointestinal Tract Microbiome: The Past, Present, and Future of Metagenomics. Biomedicines 2023, 11, 827. https://doi.org/10.3390/ biomedicines11030827
2. Harmsen D, Rothgänger J, Frosch M, Albert J. RIDOM: Ribosomal Differentiation of Medical Micro-organisms Database. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 1;30(1):416-7. doi: 10.1093/nar/30.1.416. PMID: 11752353; PMCID: PMC99060.
3. Jo, J.H., Kenendy, E.A., Kong, H.H. 2016. Research Techniques Made Simple: Bacterial 16S Ribosomal RNA Gene Sequencing in Cutaneous Research. Journal of Investigative Dermatology, (135) 3: E23-E27. https://doi.org/10.1016/j.jid.2016.01.005
4. Johnson, J.S., Spakowicz, D.J., Hong, BY. et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun 10, 5029 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-13036-1
5. Lopez-Aladid, R., Fernández-Barat, L., Alcaraz-Serrano, V. et al. Determining the most accurate 16S rRNA hypervariable region for taxonomic identification from respiratory samples. Sci Rep 13, 3974 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30764-z
6. Maidak BL, Cole JR, Lilburn TG, Parker CT Jr, Saxman PR, Farris RJ, Garrity GM, Olsen GJ, Schmidt TM, Tiedje JM. The RDP-II (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res. 2001 Jan 1;29(1):173-4. doi: 10.1093/nar/29.1.173. PMID: 11125082; PMCID: PMC29785.
7. Park, C., Kim, S.B., Choi, S.H., Kim, S. Comparison of 16S Rrna Gene Based Microbial Profiling Using Five Next-Generation Sequencers and Various Primers. Frontiers in Microbiology 12, 15500 (2021). https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.715500
8. Vetrovsky, T., Baldrian, P. 2013. The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. Plos One, (8) 2: e57923. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057923