Sebelum mengenal deep sequencing, kalian mungkin ada yang tidak familiar dengan Next Generation Sequencing, atau biasa disingkat NGS. Next Generation Sequencing merupakan teknologi sequencing generasi baru yang sering digunakan oleh para peneliti untuk sequencing genom dari organisme, seperti genom manusia, hewan, tumbuhan, maupun mikroorganisme. Dengan teknologi sequencing throughput tinggi seperti ini, kita mungkin dapat menganalisis seluruh genom manusia dalam sekali percobaan. Akan tetapi, selain NGS, ada pula metode sequencing yang lebih canggih lagi, yaitu Deep sequencing.
Mengenal teknologi sequencing generasi terbaru
Deep sequencing merupakan bagian dari NGS (Next Generation Sequencing). Deep sequencing dapat diartikan sebagai proses sequencing suatu area genetik secara berulang-ulang, terkadang ratusan bahkan ribuan kali. Para peneliti dapat menggunakan NGS untuk menemukan jenis klon, sel, atau mikroorganisme yang tidak umum, yang hanya berjumlah 1% dari sampel asli.
Pendekatan deep sequencing pertama kali ditemukan pada tahun 2005. Pendekatan unik ini digunakan dengan cepat untuk analisis genetik keragaman genom virus di banyak virus, terutama virus RNA, karena peningkatan jumlah data sequencing dan penurunan harga setiap kumpulan data sequencing. Penemuan dari deep sequencing ini menawarkan data resolusi tinggi tentang perubahan genom virus dan mengungkap epidemiologi dan evolusi virus.
Untuk apa kita menggunakan deep sequencing?
Deep sequencing digunakan untuk sequencing bertarget guna mendeteksi variasi yang diketahui dan tidak diketahui di area target. Dibandingkan dengan WGS, deep sequencing memerlukan sampel lebih sedikit dan juga data yang lebih sedikit sehingga analisis lebih mudah dikelola. Deep sequencing juga dapat digunakan untuk memantau evolusi mutasi yang menyebabkan virulensi atau resistensi obat antivirus, menemukan virus influenza dalam sampel klinis, mempelajari dan mengidentifikasi kuasispesies virus.
Fungsi lain dari deep sequencing adalah untuk mempelajari kanker, menemukan penyakit baru dan langka, serta mempelajari mikrobiologi dan penelitian lain yang melibatkan analisis populasi sel langka. Deep sequencing menghasilkan sidik jari genetik unik yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi seseorang serta sejumlah indikator penyakit genetik. Deep sequencing dapat mengungkap sejarah dan dampak paparan lingkungan dengan mengidentifikasi peristiwa epigenetik seperti perubahan metilasi DNA dan ekspresi RNA. Deep sequencing diperlukan untuk menemukan mutasi di dalam tumor karena kontaminasi sel normal tersebar luas di sampel kanker, dan tumor itu sendiri kemungkinan besar memiliki beberapa sub-klon sel kanker. Terkadang, NGS yang disebut sebagai massively parallel sequencing (MPS) atau deep sequencing telah mengubah penelitian genom karena perubahan epigenetik dapat memengaruhi aksesibilitas DNA dan struktur kromatin yang dapat memengaruhi ekspresi gen.
Deep sequencing diperlukan karena berbagai alasan. Untuk tumor dengan tingkat kemurnian rendah, tumor sangat poliklonal, dan aplikasi yang memerlukan sensitivitas tinggi, misalnya, kedalaman sequencing yang diperlukan meningkat (mengidentifikasi klon frekuensi rendah). Tingkat cakupan sequencing kanker biasanya berkisar antara 80 hingga ribuan kali lipat. Ada 3 (tiga) faktor deep sequencing pada kanker, yaitu kemurnian tumor, heterogenitas tumor, dan sensitivitas yang diperlukan. Dalam kemurniannya, tumor biasanya terdiri dari campuran jaringan normal dan ganas. Untuk menemukan mutasi tumor dengan keyakinan yang sama seperti sampel tumor murni 100%, tumor yang memiliki 50% jaringan normal memerlukan kedalaman sequencing dua kali lipat. Dalam heterogenitasnya, tumor poliklonal sering terjadi pada kanker stadium lanjut. Semakin banyak tipe klonal yang ada, semakin rinci pengurutannya agar dapat mewakili setiap tipe klonal secara memadai. Untuk sensitivitas yang diperlukan, pada saat terjadi kekambuhan resistensi obat, klon yang mewakili 1% tumor asli berpotensi menjadi klon dominan. Jika tumor tidak mengandung jaringan normal, klon 1% hanya akan terwakili satu kali dalam 100 cakupan.
Menganalisis ultra-deep sequencing yang dikumpulkan dari berbagai populasi virus merupakan suatu tantangan, dan eksperimen ini hanya memberikan bukti tidak langsung tentang struktur populasi virus yang mendasarinya karena kesalahan PCR dan sequencing, serta panjang pembacaan yang rendah. Beberapa efek perancu kini dapat diakomodasi berkat terobosan komputasi dan statistik terkini, seperti koreksi kesalahan baca, rekonstruksi haplotype, dan estimasi frekuensi haplotype.
Daftar Pustaka
[1] Beerenwinkel, N., & Zagordi, O. (2011). Ultra-deep sequencing for the analysis of viral populations. Current Opinion in Virology, 1(5), 413–418. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2011.07.008
[2] Goldman, D., & Domschke, K. (2014). Making sense of deep sequencing. The international journal of neuropsychopharmacology, 17(10), 1717–1725. https://doi.org/10.1017/S1461145714000789
[3] Gong, B., Deveson, I.W., Mercer, T. et al. Ultra-deep sequencing data from a liquid biopsy proficiency study demonstrating analytic validity. Sci Data 9, 170 (2022). https://doi.org/10.1038/s41597-022-01276-8
[4] Hsu, F.-M., Gohain, M., Chang, P., Lu, J.-H., & Chen, P.-Y. (2018). Bioinformatics of Epigenomic Data Generated From Next-Generation Sequencing. Epigenetics in Human Disease, 65–106. doi:10.1016/b978-0-12-812215-0.00004-2
[5] Huang, S.-W., Hung, S.-J., & Wang, J.-R. (2019). Application of deep sequencing methods for inferring viral population diversity. Journal of Virological Methods. doi:10.1016/j.jviromet.2019.01.01
[6] Jessica DeWitt, P. Targeted next generation sequencing (NGS): IDT, Integrated DNA Technologies. Available at: https://sg.idtdna.com/pages/technology/next-generation-sequencing/dna-sequencing/targeted-sequencing (Accessed: 22 September 2023).
[7] Illumina. Next-generation sequencing (NGS) Explore the technology. Available at: https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing.html (Accessed: 22 September 2023).
