Pengertian dan Mekanisme Kerja CRISPR-Cas9

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats yang disingkat menjadi CRISPR adalah suatu segmen DNA tertentu pada prokariota (bakteri dan archaea) yang terdiri dari sekuens atau urutan nukleotida dengan repitisi pendek. Masing-masing repetisi tersebut diikuti dengan segmen pendek lainnya yakni DNA Spacer secara selang-seling (Gambar 1). Pada genom bakteri, 40% genomnya tersusun atas CRISPR sedangkan pada genom archaea tersusun 90%. Fungsi dari gen CRISPR adalah sebagai sistem imun pada prokarita tersebut dari infeksi, konjugasi, dan transformasi akibat serangan meteri genetik asing.

CRISPR associated proteins yang disingkat menjadi Cas adalah enzim endonuklease yang dihasilkan oleh gen dari “cas operon”. Gen cas terdapat dua kelas, yakni kelas 1 yang merupakan sistem kompleks untuk memotong materi genetik asing, sedangkan kelas 2 hanya menggunakan protein tunggal dengan tujuan yang sama. Masing-masing kelas tersebut dibagi lagi menjadi tipe cas. Pada bahasan kali ini fokus pada kelas 2 yang menghasilkan tipe Cas9 dan tipe cas yang lainnya pada Gambar 1.

Komponen protein Cas9 tersusun atas empat yakni terdiri dari dua domain protein utama yakni REC dan RuvC (Gambar 2). REC dan RuvC dihubungkan oleh daerah yang kaya akan asam amino arginin (warna biru). Sementara dua komponen berikutnya yakni HNH dan PAM (Protosapecer-Adjacent Motif) yang merupakan urutan DNA yang tersusun 2-6 bp.

Fungsi masing-masing komponen Cas9 yakni REC dan NHN berfungsi sebagai endonuklease (memotong DNA); RuvC berfungsi sebagai daerah sisi pengenalan (recognition site); PAM berfungsi untuk menyisipi urutan DNA target dengan segera ketika Cas9 mengenali DNA asing yang dijadikan target. PAM juga sebagai pengunci dalam proses sistem CRISPR/Cas9.

Sistem CRISPR-Cas9 adalah dua komponen penting yang sinergis untuk menghancurkan materi genetik asing. Secara alami, pada saat bakteri atau archaea terinfeksi materi genetik asing seperti bakteriofag, maka proses kerja CRISPR-Cas9 ada tiga mekanisme utama yakni akuisisi DNA, pemrosesan crRNA, dan interferensi yang disajikan dalam Gambar 3 sebagai berikut:

Gambar 3. Mekanisme kerja CRISPR-Cas9 pada Prokariota.

Keterangan dari Gambar 3 tersebut yakni, (1) pada saat DNA asing masuk ke dalam sel, maka dengan segera (2) fragmen DNA asing tersebut akan direkam sebagai memori genetik dan disimpan dalam spacer yang disebut dengan tahapan akuisisi DNA. Ketika ada virus dengan fragmen DNA yang sudah pernah direkam, langkah selanjutnya adalah pemrosesan crRNA. (3) Gen CRISPR akan melakukan transkripsi menghasilkan CRISPR RNA (crRNA) sedangan gen Cas9 akan menghasilkan protein Cas9.

(4) tracrRNA juga disintesis (lokasi gen di Gambar 1) dan bergabung dengan crRNA. Gabungan kedua RNA tersebut dinamakan guide RNA (gRNA) atau disebut RNA Pemandu. Selanjutnya, (5) RNA pemandu akan bergabung dengan Cas9. (6) Kompleks RNA Pemandu/Cas9 akan mengikat DNA asing dan (7) memotongannya menjadi DNA inaktif.

Meretas Sistem DNA

Dengan diketahui cara kerja CRISPR-Cas9, Martin Jinek, dkk mempublikasikan sebuah jurnal penelitian dengan judul “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity” pada Agustus 2012 yang menyebutkan bahwa sistem CRISPR-Cas9 bersifat progammable sehingga dengan mudahnya melakukan pengeditan pada genom.

Setelah adanya penemuan editing genome, pada tahun 2013, publikasi mengenai CRISPR/Cas9 hingga sekarang muncul bertubi-tubi. Berawal dari eksplorasi kini menjadi ekploitasi besar-besaran dalam skala molekuler. Berikut adalah hasil penelitian mengenai program aplikasi CRISPR-Cas9 selama tahun 2013:

1. Januari 2013: digunakan untuk rekayasa genom manusia dan ikan zebra
2. Februari 2013: digunakan untuk program represi dan aktivasi gen transkripsi
3. Maret 2013: digunakan untuk rekayasa genom Saccharomuces cerevisae
4. April 2013: digunakan untuk regulasi gen bakteri.
5. Mei 2013: digunakan untuk rekayasa genom Drosophila
6. Juni 2013: digunakan untuk mutagenesis dan digunakan untuk rekayasa genom cacing Caenorhabditis elegans
7. September 2013: digunakan untuk memperbanyak rekayasa genom.
8. Oktober 2013: digunakan untuk rekayasa genom ulat sutera dan digunakan untuk rekayasa genom katak Xenopus tropicalis. 
9. November 2013: Penemuan sekuens target, RNA pemandu, dan Cas9 berkontribusi untuk menghindari efek salah target.
10. Desember 2013: digunakan untuk mengoreksi penyakit genetik; dan untuk screening genom manusia.