Materi dan Panduan Enumerasi Mikroba, Dilengkapi Gambar

Pertumbuhan mikroba dapat diketahui dengan adanya pertambahan ukuran, pertambahan jumlah, dan perubahan total kandungan materi selular dari mikroba di dalam suatu populasi (Hogg 2005). Mengingat hal tersebut, terjadinya pertumbuhan mikroba dapat diketahui dengan melakukan perhitungan terhadap jumlahnya atau kandungan biomassanya. Enumerasi mikroba adalah teknik yang digunakan untuk mengestimasi jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan atau sampel. Pengertian enumerasi mikorba tersebut menyatakan bahwa jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan sangat bervariasi dan sulit diketahui dengan pasti, sehingga diperlukan cara perhitungan tertentu untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan. Teknik enumerasi mikroba ada dua yakni metode enumerasi mikroba secara langsung dan cara tidak langsung (Gandjar dkk. 1992).

Enumerasi mikroorganisme secara langsung merupakan cara perhitungan terhadap total dari jumlah sel mikroba dalam suatu sampel secara mikroskopik. Enumerasi secara langsung dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode perhitungan dengan kamar hitung (Counting chamber) dan perhitungan dengan preparat olesan (Smear count). Metode perhitungan dengan kamar hitung prinsipnya mirip seperti perhitungan sel darah merah. Keduanya memakai kamar hitung hemositometer (haemocytometer) untuk menerima sampel yang sangat kecil yang disebar di atas kotak-kotak dalam kamar hitung. Selanjutnya, jumlah mikroorganisme dalam kotak-kotak tersebut dikalikan dengan volume sampel sehingga didapatkan jumlah mikroorganisme per ml sampel (Gandjar dkk. 1992; Talaro 2002).  Berikut adalah gambar hemositometer!

Gambar 1. Bagian hemositometer.

Cara kerja menggunakan hemositometer untuk enumerasi bakteri adalah:

1. Menentukan plot ( 5 kotak yang bergaris tebal dan terdiri dari atas kotak kecil-kecil).
2. Menghitung jumlah bakteri yang ada dalam masing-masing kotak yang besar (bakteri yang tepat pada garis tepi dihitung satu kali).
3. Menjumlah bakteri dari seluruh kotak yang besar kemudian dirata-rata.
4. Menghitung konsentrasi bakteri/ml dengan cara memasukkan ke rumus volume

Sementara itu, perhitungan menggunakan metode preparat olesan dilakukan dengan membuat preparat oles dari volume tertentu dan disebar di gelas objek dengan luas tertentu pula. Setelah itu, dengan mengetahui luas bidang mikroskop dan jumlah mikroorganisme yang ada dalam bidang, maka jumlah mikroorganisme per ml sampel dapat diketahui (Gandjar dkk. 1992). Kelebihan enumerasi mikroorganisme secara langsung adalah dapat menghitung jumlah mikroorganisme lebih cepat dan dapat mengetahui informasi tambahan tentang mikroba yang sedang dihitung (Madigan dkk. 2011). Kekurangan dari perhitungan mikroorganisme secara langsung ialah sel bakteri yang mati dianggap seperti sel yang hidup, sel bakteri yang motil sulit dihitung dengan pasti, dan sel yang sedang dihitung perlu mencapai jumlah konsentrasi yang memadai untuk dihitung, sekitar 10 juta bakteri per ml (Tortora dkk. 2010). 

Perhitungan mikroorganisme secara tidak langsung mempunyai berbagai metode yang berbeda. Metode-metode yang dapat dilakukan untuk menghitung mikroorganisme secara tidak langsung antara lain dengan turbidometer, dengan cara kimia, dengan cara volume total, dengan cara berat kering, dengan kultur tabung putar, dan enumerasi mikroba dengan metode total plate count (TPC)(Gandjar dkk. 1992). Keuntungan menggunakan metode enumerasi mikroorganisme secara tidak langsung adalah perhitungan hanya kepada mikroba yang masih hidup sehingga hasilnya lebih akurat. Kekurangan dalam metode perhitungan tidak langsung adalah membutuhkan waktu inkubasi yang lama sehingga hasilnya tidak didapat dengan waktu yang cepat. Perhitungan mikroba secara tidak langsung memiliki sensitifitas yang tinggi sehingga metode tersebut cocok digunakan untuk deteksi sensitif dari kontaminasi mikroba pada makanan dan materi yang lain (Madigan dkk. 2011).

.

Salah satu metode enumerasi mikroorganisme secara tidak langsung ialah total plate count (TPC) atau enumerasi mikroba dengan metode angka lempeng total (ALT). Metode enumerasi mikroorganisme dengan TPC mempunyai prinsip hanya menghitung jumlah bakteri yang hidup, yaitu yang dapat membelah dan membentuk keturunan. Dengan kata lain, metode total plate count disebut juga dengan metode viable count. Metode total plate count tidak dapat menghitung setiap sel tunggal bakteri, akan tetapi menghitung jumlah koloni yang jelas terlihat atau representatif (Madigan dkk. 2011).  

Penghitungan jumlah koloni berdasarkan pada alasan bahwa setiap koloni yang terlihat merupakan hasil dari pemebelahan sel tunggal bakteri, walaupun sebenarnya tidak selamanya tepat (Hogg 2005; Tortora dkk. 2010).  Mengingat hal tersebut, metode total plate count diekspresikan dalam colony forming unit (CFU), bukannya sel tunggal, per unit volum (Hogg 2005). Colony forming unit merupakan unit yang membentuk koloni, satu koloni merepresentasikan satu sel tunggal.  Metode perhitungan mikroorganisme total plate count dapat dilakukan dengan dua jalan, yaitu secara spread-plate dan pour-plate (Madigan dkk. 2011). 

Umumnya, koloni yang dihitung pada metode TPC sulit dihitung karena koloni yang akan dihitung sangat banyak. Untuk mengatasi hal tersebut, diperlukan suatu serial pengenceran. Sampel yang akan diperiksa biasanya diencerkan sebanyak 10 kali pada setiap seri. Pengenceran dilakukan sampai konsentrasi tertentu, kemudian diambil sejumlah volume tertentu dari pengenceran dan ditanam secara pour plate atau spread plate di atas medium yang sesuai. Setelah diinkubasikan, ambil cawan petri yang mempunyai pertumbuhan koloni antara 30 – 300 koloni.  Jumlah mikroorganisme per 1 ml sampel dapat diperoleh dengan mengkalikan jumlah CFU yang terhitung dengan volume sampel yang diinokulasikan, kemudian dibagi dengan pengenceran yang digunakan (Gandjar dkk. 1992; Madigan dkk. 2011; Tortora dkk. 2010:).

Cara enumerasi mikroorganisme dengan total plate count

1. Sediakan tabung reaksi sesuai dengan jumlah pengenceran, misal 5 tabung. Masing-masing tabung diisi dengan medium atau aquades sebanyak 9 ml.
2. Membuat pengenceran sampel yang akan diperiksa mulai dari 10^-1 hingga 10^-5. Caranya yakni memasukkan 1 ml sampel atau inokulum awal ke dalam tabung reaksi pertama kemudian kocok, maka konsentrasi tabung reaksi pertama adalah 10^-1. Selanjutnya ambil 1 ml larutan dari tabung reaksi pertama ke dalam tabung reaksi kedua dan kocok hingga homogen, maka tabung kedua konsentrasi menjadi 10^-2. Lakukan proses tersebut hingga tabung ke-5
3. Sediakan 5 cawan petri yang berisi medium bakteri. Beri tanda sesuai dengan urutan pengenceran tabung reaksi.
4. Ambil masing-masing pengenceran dari kelima tabung sesuai dengan jenis pengenceranya ke dalam cawan petri.
5. Inkubasikan biakan bakteri tersebut selama 24-48 jam di dalam inkubator.
6. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada setiap pengenceran. Jumlah bakteri yang ada dalam 1 ml sampel adalah berbanding terbalik dengan pengenceran. Sebagai contoh hasil dari pengenceran 10^-5 terdapat 10 koloni, maka jumlah bakteri adalah 10 x 10^-5 sel bakteri per 1 ml sampel.

Pengamatan koloni dilakukan selama tahap 24 jam dan 48 jam. Hal tersebut dikarenakan pertumbuhan sudah mulai terlihat secara signifikan pada waktu 48 jam, kemungkinan pada waktu tersebut merupakan fase log dari pertumbuhan mikroba. Fase log merupakan fase mikroba mengalami pembelahan sel. Ketika pengamatan pada tahap 24 jam dilakukan, kemungkinan mikroba masih berada pada fase lag, yaitu fase mikroba tidak mengalami pembelahan sel dan peningkatan aktivitas metabolisme (Tortora dkk. 2010).

Satuan yang dipakai dalam penghitungan TPC adalah CFU (Colony Forming Units).  Satuan tersebut digunakan karena lebih dari satu mikroorganisme dapat hidup dalam satu koloni.  Rumus yang digunakan adalah:

Daftar Pustaka

• Dwidjoseputro, D. 2003. Dasar-dasar mikrobiologi.
• Gandjar, I., I.R. Koentjoro., W. Mangunwardoyo. & L. Soebagya. 1992. Pedoman praktikum mikrobiologi dasar. 
• Hariyadi, R.D. 2000. Dasar-dasar mikrobiologi pangan. Pusat Kajian Makanan Tradisional Lembaga Penelitian IPB 
• Harley & Prescott. 2002. Laboratory exercises in microbiology, 5th ed.
• Hogg, S. 2005. Essential microbiology. 
• Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun, Suhadi & Susanto. 1980. Pedoman praktikum mikrobiologi umum. 
• Madigan, M. T., J. M. Martinko, D. A. Stahl, D. P. Clark. 2011. Brock biology of microorganisms, 13th ed. 
• McKane, L. & J. Kandel. 1996. Microbiology: Essential and application. 
• Pelczar, M.J. & E.C.S Chan. 1986. Dasar-dasar mikrobiologi.
• Sutedjo, M.M., A.G. Kartasapoetra & R.S. Sastroadmojo. 1991. Mikrobiologi tanah. 
• Talaro, K. P. & A. Talaro. 2002. Foundations in microbiology, 4th ed. 
• Tortora, G. J., B. R. Funke & C. L. Case. 2010. Microbiology: An introduction, 10th ed. 
• Volk, W.A. & M.F. Wheeler. 1993. Mikrobiologi dasar. Ed ke-5.