Kultur jaringan termasuk dalam ruang lingkup bioteknologi. Bioteknologi kultur jaringan adalah teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Arti secara buatan adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan dan sering kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin, berarti “di dalam kaca”) karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan Petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan pada dasarnya dapat dilakukan baik pada tumbuhan maupun hewan, karena sel tumbuhan dan sel hewan memiliki sifat totipotensi.
Totipotensi adalah kemampuan sel-sel / jaringan untuk tumbuh menjadi individu baru yang identik dengan induknya, karena sel-sel/ jaringan tersebut memilki sifat metabolisme. Tetapi untuk mengkultur jaringan yang berbeda, maka memerlukan komposisi media tertentu.
Kultur Jaringan Hewan
Definisi kultur jaringan hewan adalah adanya sifat totipotensi sel yaitu setiap sel mengandung seluruh informasi genetik dan mempunyai kemampuan untuk dapat berkembang menjadi individu yang sama dengan induknya. Saat ini, kultur jaringan tumbuhan berkembang lebih pesat daripada kultur jaringan hewan, mengingat kultur jaringan tumbuhan lebih mudah dilakukan dengan biaya yang relatif murah dan angka keberhasilan yang lebih tinggi. Hal ini disebabkan karena sel-sel tumbuhan memiliki daya totipotensi yang lebih tinggi daripada sel hewan. Sel hewan memilki struktur yang lebih komplek daripada sel tumbuhan baik secara morfologi maupun fisiologis (aktivitas metabolisme lebih banyak). Peralatan yang digunakan dalam kultur jaringan hewan lebih mahal serta faktor teknis dalam kultur jaringan hewan lebih sulit.
Untuk menunjang keberhasilan kultur jaringan hewan, maka dalam melaksanakan kultur jaringan hewan ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Prasyarat yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh (membelah dan berkembangbiak) dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh harus mengandung berbagai bahan/ nutrisi yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya seperti air, vitamin, mineral dan hormon.
Medium Kultur Jaringan Hewan
Di dalam media kultur jaringan hewan harus terdapat kondisi fisik yang optimal meliputi pH, tekanan, sumber energi dan sumber karbon, asam amino, vitamin, mineral dan air. Berdasarkan asalnya, media dibagi menjadi 2, yaitu:
- Media alami adalah media yang berasal dari cairan jaringan embrio dan medium plasma darah. Plasma darah merupakan komponen terbesar dalam darah, karena lebih dari separuh darah mengandung plasma darah. Hampir 90% bagian dari plasma darah adalah air. Plasma darah berfungsi untuk mengangkut sari makanan ke sel-sel serta membawa sisa pembakaran dari sel ke tempat pembuangan
- Media sintetik adalah media yang dibuat secara kimia, misalnya: DMEM, RPMI.
Media untuk kultur sel dan jaringan harus mengandung sumber energi dan sumber karbon (karbohidrat), asam amino (protein), vitamin, mineral, dan air. Hal ini berlaku baik untuk kultur sel dan jaringan hewan maupun tumbuhan.
Sampai saat ini telah dilakukan banyak penelitian tentang media untuk kultur sel dan jaringan hewan maupun tumbuhan. Pada dasarnya medium untuk kultur sel dan jaringan dapat berupa media alami maupun buatan.
Media Alami
Media alami ialah media yang diperoleh dari bahan-bahan alami seperti ekstrak buah-buahan, darah, ekstrak sel dan lain-lainya. Komposisi kimia yang pasti dari suatu media alami tidak diketahui. Media alami merupakan media yang kompleks yaitu mengandung karbon, sumber N (asam amino) vitamin, mineral, air, serta hormon dan enzim-enzim. Kultur jaringan tumbuhan dapat menggunakan media alami maupun media buatan dengan tingkat keberhasilan yang sama, tetapi pada kultur jaringan hewan penggunaan media alami seperti serum juga memberikan tingkat keberhasilan yang tinggi pada kultur jaringan hewan.
Bahan alami yang digunakan untuk menumbuhkan sel dari jaringan dapat dikelompokkan dalam tiga kategori, yaitu:
- Koagulat, misalnya koagulan plasma darah dan kolagen.
- Cairan bologis, misalnya serum.
- Ekstrak jaringan, misalnya ekstrak embrio.
Plasma darah merupakan salah satu contoh media alami dalam kultur jaringan hewan. Darah adalah cairan yang terdapat pada semua hewan tingkat tinggi yang berfungsi mengirimkan zat-zat dan oksigen yang dibutuhkan oleh jaringan tubuh, mengangkut bahan-bahan kimia hasil metabolisme, dan juga sebagai pertahanan tubuh terhadap virus atau bakteri. Istilah medis yang berkaitan dengan darah diawali dengan kata hemo- atau hemato- yang berasal dari bahasa Yunani haima yang berarti darah.
Darah terdiri dari dua komponen yaitu plasma darah dan sel-sel darah. Plasma darah adalah bagian darah yang cair. Plasma darah ini digunakan sebagai media alami dalam kultur jaringan hewan, karena plasma darah mengandung berbagai nutrisi yang diperlukan oleh sel-sel/ jaringan yang sedang dikultur, untuk tumbuh (membelah dan berkembangbiak). Plasma darah mengandung 91,5% air dan 8,5% zat-zat terlarut. Zat-zat yang terlarut dalam plasma darah meliputi molekul-molekul dan berbagai ion yaitu glukosa sebagai sumber energi dan asam-asam amino. Ion-ion yang terdapat dalam plasma darah adalah ion Natrium (Na+) dan Klor (Cl-). Plasma darah mengandung 7% molekul-molekul protein seperti; serum albumin 4%, serum globulin 2,7% dan fibrinogen 0,3%. Serum adalah cairan darah yang tidak mengandung fibrinogen (komponen yang berperan dalam proses pembekuan darah).
Media Buatan
Media alami tidak dapat ditentukan komponen-komponen penyusuna secara pasti, demikian juga dengan prosentase masing-masing komponen masih belum dapat ditentukan. Hal ini disebabkan media alami adalah media yang kompleks. Oleh sebab itu media alami kurang tepat jika digunakan dalam penelitian.
Pada saat ini telah dikembangkan media buatan. Media buatan komposisinya dan prosentase kandungan zat-zat nutriennya dapat diketahui dengan pasti. Disamping itu, media buatan dapat diamanipulasi komposisi komponen penyusunya sehingga media buatan sangat cocok digunakan dalam percobaan dan penelitian.
Media buatan dapat memberikan hasil ang sama baiknya dengan media alami apabila komponen-komponen dan kondosi fisik yang diperlukan oleh sel atau jaringan yang dikultur pada media tersebut terpenuhi.
Sedangkan berdasarkan kebutuhannya media dibagi menjadi 3, yaitu:
- Minimum essential medium (MEM) adalah yaitu medium dasar yang tersusun atas BSS, asam amino esensial dan vitamin.
- Medium pemelihara (maintenance medium/mm) adalah medium yang digunakan untuk memelihara kehidupan sel dalam metabolisme rendah dan jangka waktu agak lama. Medium ini terdiri dari mem dan serum konsentrasi rendah (2 – 5 %).
- Medium penumbuh (growth medium) adalah medium yang diperkaya dengan nutrien-nutrien untuk menumbuhkan kultur sel secara cepat, medium ini ditambahkan serum cukup banyak (10 – 20 %).
Eksplan Dalam Kultur Jaringan Hewan
Eksplan untuk kultur jaringan hewan biasanya didapatkan dari sumber yang berbeda, yaitu dari embrio dan jaringan hewan dewasa. Kultur embrio bermanfaat untuk memperpendek siklus perkembangbiakan dan menghindari keguguran embrio. Jaringan embrionik yang digunakan pada kultur jaringan hewan pada dasarnya sudah steril. Jika pada saat pengambilan eksplan diterapkan teknik aseptik, maka jaringan embrio tersebut sudah siap digunakan. Jaringan embrionik dapat tumbuh dengan cepat, tidak tergregasi dan bermigrasi dengan cepat. Mitosis pada jaringan embrionik segera terjadi setelah dikultur. Sedangkan jaringan yang diambil dari hewan dewasa yang dapat tumbuh cepat biasanya adalah sel-sel epitel dan jaringan tumor.
Jaringan embrionik telor ayam yang digunakan pada ini tersusun oleh sel-sel fibroblas. Sel fibroblas adalah sel penyusun jaringan ikat longgar yang berbentuk serat dan mensekerikan protein ke matriks.
Teknik Kultur Jaringan Pada Hewan
Cara kultur jaringan hewan harus dilakukan pada suatu ukuran kecil (area yang relatif kecil) untuk meminimalkan kemungkinan terjadinya kontaminasi. Keadaan lingkungan baik didalam kultur (media) maupun diluar kultur (udara, praktikan/ manusia yang melakukan kultur, kondisi laboratorium) harus dioptimalkan. Selama kultur, faktor fisik seperti unsur hara dan hormon harus diperhatikan. Semua sumber kontaminasi (ruangan laboratorium, laminer dan alat-alat bedah untuk kultur) harus ditiadakan dengan cara sterilisasi.
Berdasarkan tempat yang digunakan untuk kultur sel atau jaringan hewan terdapat 3 teknik kultur jaringan yaitu :
- Slide Culture adalah yaitu menumbuhkan kultur sel pada gelas obyek cekung.
- Flask Culture adalah menumbuhkan kultur sel pada cawan kultur.
- Test-tube Culture adalah menumbuhkan kultur sel pada tabung reaksi, botol terutama untuk jenis sel yang tidak melekat.
Flask Culture
Flask Culture memberikan keuntungan lebih jika dibandingkan dengan slide culture. Dengan Flask Culture jaringan dapat dikultur sampai berbulan-bulan, bahkan bertaun-tahun. Sejumlah besar kultur dapat dipersiapkan secara komperatif. Kultur dapat berkembang lebih pesat. Medium dapat dapat diambil untuk keperluan pengujian, fase gas dapat dikontrol dengan mudah dan jumlah medium dapat dapat diukur secara tepat. Wadah yang baik untuk flask culture adalah Carrel flask.
Terdapat dua tipe Flask Culture, yaitu Thick Clot Culture dan Thin Clot Culture. Thick Clot Culture sangat baik untuk mendukung pertumbuhan yang cepat dari suatu kultur jaringan. Lapisan medium dari Thick Culture dapt diambil beserta eksplanya untuk keperluan pewarnaan. Sedangkan Thin Culture sangat baik sebagai uji pengaruh makanan pada medium terhadap kultur.
Prosedur pelaksanaan Flask Culture sebagai berikut:
- Mengambil beberapa carrel flask yang berdiameter 3,5 cm dan membakar bagian mulut cawan/tepi tesebut.
- Meneteskan satu tetes plasma ke dasar cawan dan menebarkan plasma tersebut denga spatula.
- Dengan menggunakan spatula, memasukkan sejumlah eksplan kedalam cawan dan mengatur posisinya.
- Sesudah plasma mengeras maka eksplan akan terfiksasi pada posisi masing-masing, kemudian menambahkan medium ekstra. Untuk thick culture yang ditambahkan adalah serum dengan konsentrasi dan volume yang sama.
- Kemudian hasilnya disimpan dalam cawan dan disimpan dalam inkubator yang mengandung gas CO2 5%.
Penggantian medium pada Flask Culture dapat ditempuh dengan cara sebagai berikut:
1. Medium yang lama disedot dengan menggunakan pipet untuk dibuang.
2. Menambahkan medium baru dengan volume 1,2 ml.
3. Cawan dimasukkan kedalam inkubator yang mengandung CO2 seperti semula.
Pada thick clot culture penggatian medium dapat dtempuh dengan jalan cawan dibalik dan plasma dialirkan selama bebepara jam. Selanjutnya diberikan medium baru. Dalam kasus tertentu penambahan lapisan plsma dapat ditempuh dengan jalan meneteskan plasma segar supaya membentuk lapisan.
Flask Culture juga memungkinkan untuk dilakukan pemindahan eksplan. Eksplan yang telah tumbuh dapat diambil dengan mudah dan dipotong-potong menjadi beberapa potongan dan masing-masing potongan dapat diperlakukan sebagai eksplan.
Adapun gambaran laboratorium kultur jaringan hewan adalah:
Contoh Langkah Kerja Proses Pembuatan Kultur Jaringan Hewan dengan Menggunakan Media Alami
Pembuatan Media Alami
- Mensterilkan Laminar Air Flow (LAF) dan ruangan dengan sinar UV selama 2 jam.
- Menyiapkan alat-alat yang telah disterilkan antara lain: spet 1 ml; membran milipore; botol kaca dengan diameter mulut 3 cm; aluminium foil; pembakar spiritus.
- Menyiapkan bahan-bahan antara lain: darah ayam yang segar yang telah diberi amonium oksalat sebagai antikoagulan; alkohol 70%; spirtus.
- Mensentrifuge darah selama 30 x 2 menit, sehingga terbentuk lapisan plasma darah (bagian atas) dan lapisan sel-sel darah (bagian bawah).
- Menyiapkan spet yang diambil bagian jarumnya.
- Membuka kemasan membran milipore, menggabungkan ujung spet dengan salah satu bagian pada permukaan atas membran milipore.
- Menempelkan membran milipore pada mulut botol dengan bantuan spet secara aseptik. Bagian tepi dipegang agar membran tidak bergeser.
- Melepaskan spet dari membran milipore, kemudian mengambil lapisan plasma darah dengan spet.
- Menyaring plasma darah ke dalam botol melalui membran milipore.
- Setelah semua plasma darah tersaring ke dalam botol, lalu mengambil membran milipore dan menutup botol dengan penutupnya. Kemudian ditutup lagi dengan aluminium foil.
Keterangan : langkah kerja no. 5 –10 dilakukan di Laminar Air Flow (LAF} dan secara aseptik.
Langkah Kerja Preparasi Sel-sel Fibroblas & Penginokulasian
- Mensterilkan Laminar Air Flow (LAF) dan ruangan dengan sinar UV selama 2 jam.
- Menyiapkan alat-alat antara lain: spet 1 ml (6 buah); gunting bedah; pinset; cawan petri; cawan kultur; botol vial; stirel; aluminium foil;. yang telah disterilisasi dengan menggunakan oven pada suhu 160 0C selama 2 jam. Selain itu juga menyiapkan pembakar spiritus dan inverted microscope untuk mengamati pertumbuhan sel-sel fibroblast dalam cawan kultur.
- Menyiapkan telur ayam umur 9 hari.
- Menyemprot telur dengan alcohol 70% kemudian memecah telur pada bagian ujung yang tumpul, mengambil embrio, meletakkan pada cawan petri steril yang telah diberi larutan PBS.
- Memotong bagian leher embrio dalam larutan PBS dengan gunting, kemudian memotong bagian sayap dan kaki.
- Memotong embrio sekecil mungkin.
- Menyiapkan tabung sentrifuge yang telah diisi PBS kemudian memasukkan potongan embrio ke dalam tabung tersebut.
- Mengurangi PBS di dalam tabung sentrifuge yang berisi potongan embrio sampai volumenya 5 ml, kemudian menambahkan tripsin dengan perbandingan 1 : 1.
- Memanasi tabung yang berisi potongan embrio tersebut ke dalam air mendidih dengan suhu 37 – 40 derajat Celcius selama 5 menit kemudian digoyang-goyang selama 5 menit, dan diulangi sampai 3 kali.
- Mengamati dengan menggunakan mikroskop inverted, jika tripsinasi belum berhasil maka perlu diulang lagi.
- Mensentrifuge potongan embrio dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit, sehingga sel terkumpul di dasar tabung.
- Menyedot PBS dengan menggunakan syringe, kemudian endapan sel diberi medium plasma darah ayam.Suspensi sel dalam medium disaring dengan menggunakan kain nilon T 100 steril berlapis 3 – 4.
- Menanam suspensi sel dalam cawan kultur, kemudian diinkubasikan di dalam inkubator dengan suhu 37 C.
- Mengamati perkembangan sel setiap hari (minimal 3 hari sekali) dengan menggunakan mikroskop inverted.
Untuk mengetahui hasil percobaan praktikum kultur jaringan hewan, silahkan dibaca di:
